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　　問(wèn)題解析：熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線

　　熒光定量 PCR反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)這個(gè)問(wèn)題的常見(jiàn)原因，主要可以歸結(jié)為以下幾種：

　　反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般建議設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40。

　　程序中未設(shè)置信號(hào)采集步驟：注意，兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段;三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在 72 度延伸階段。

　　引物降解：長(zhǎng)時(shí)間未使用的引物應(yīng)先通過(guò) PAGE 電泳檢測(cè)完整性，以排除引物降解的可能性。

　　模板濃度太低：這個(gè)大家減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以了，一般來(lái)說(shuō)，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

　　模板降解：無(wú)解，請(qǐng)重新制備模板，可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

　　溶解曲線形狀異常

　　(1)雜峰在主峰之前，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

　　這種情況主要有三個(gè)解決方法：

　　重新設(shè)計(jì)引物;

　　雜峰為引物二聚體，熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結(jié)合更容易導(dǎo)致的，可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來(lái)進(jìn)行改善;

　　另外，當(dāng)目的基因表達(dá)量極低時(shí)，染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此時(shí)，建議使用探針?lè)ǘ俊?/p>

　　(2)雜峰在主峰之后，非引物二聚體

　　上圖這種情況就是非特異性擴(kuò)增，可能是引物特異性不好引起的，也可能是空氣中有氣溶膠污染所導(dǎo)致。

　　大家可以先增加退火溫度再試試看，如果沒(méi)有改善，那么就需要重新更換引物啦。

　　為了避免這種麻煩，BUNSEN本生小編建議大家在進(jìn)行熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)之前，就對(duì)自己的引物做一個(gè)特異性驗(yàn)證。另外，每次試驗(yàn)的 NTC(no template control)是一定要做的。

　　(3)只有引物二聚體，無(wú)目的條帶

　　如果擴(kuò)增片段過(guò)短(小于 80bp)，那么僅通過(guò)融解曲線就很難區(qū)分引物二聚/目的條帶。

　　另外，也有可能是 熒光定量 PCR 擴(kuò)增效率低或者沒(méi)有擴(kuò)增，體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了。

　　總之，產(chǎn)物長(zhǎng)度建議大家還是設(shè)置在 100 - 200 bp，不要太短了。

　　注：以上資料僅供參考!

　　熒光定量PCR 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng)，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們?cè)概c您真誠(chéng)合作，共創(chuàng)美好的未來(lái)。